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鴻朗科技帶您了解母乳中氨基酸的檢測
更新時(shí)間:2018-04-12   點(diǎn)擊次數(shù):1959次

 

母乳是嬰兒成長過程中重要的食品,國內(nèi)外的孕嬰保健機(jī)構(gòu)都建議初生嬰兒采用母乳喂養(yǎng)。母乳中含有的營養(yǎng)成分,如蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等,易于嬰兒吸收。另外其所含有的抗感染因子,如IgA、乳鐵蛋白、溶菌酶及各種細(xì)胞成分,可增強(qiáng)嬰兒的免疫能力。因此,母乳中營養(yǎng)成分研究也成為營養(yǎng)學(xué)的一大領(lǐng)域。目前,已有對(duì)母乳中的維生素進(jìn)行研究并加以報(bào)道,但少有氨基酸的研究報(bào)道。本研究采用酸性條件下水解母乳中蛋白質(zhì),柱前在線衍生與液相色譜紫外聯(lián)用分析母乳中氨基酸。

 

樣品前處理

 

17種氨基酸混標(biāo)溶液(除胱氨酸濃度為1.25μmol/ml,其它氨基酸濃度為2.5μmol/ml)

 

7M鹽酸:量取558ml鹽酸,用水稀釋至1000ml量瓶中,搖勻。

 

樣品由第三方醫(yī)療機(jī)構(gòu)收集不同哺乳期婦女的乳液樣品。樣品呈乳白色懸濁液(含有少量黃色液體油脂。低溫保存時(shí),樣品取出后放置在40°C水浴中使固體油脂融化)。

 

水解:吸取1ml脫脂后的母乳樣品轉(zhuǎn)移至真空水解管中,加入0.6ml水解催化劑,在0.05MPa壓力下充氮保護(hù)3分鐘,再減壓脫氣3分鐘,密塞水解管并置于沸水浴上恒溫加熱8小時(shí),冷卻至室溫,用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值2-3范圍內(nèi),用0.1N鹽酸溶液稀釋并定容至10ml,搖勻并用微孔(0.22μm)濾膜過濾用于液相分析。

 

 

衍生程序

采用鄰苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯在堿性條件下分別與一級(jí)氨基酸和二級(jí)氨基酸發(fā)生反應(yīng),生成具有強(qiáng)烈紫外吸收的化合物。衍生過程在自動(dòng)進(jìn)樣器中進(jìn)行。

 

衍生試劑:

硼酸緩沖液: 200mM 四硼酸鈉溶液(pH=10.2)

鄰苯二甲醛溶液(OPA):50mg/ml(甲醇)

OPA/MPA溶液:0.8ml 硼酸緩沖液-0.2ml OPA溶液-20μl 3-巰基丙酸

氯甲酸芴甲酯(FMOC)溶液:2.5mg/ml(乙腈)

稀釋液:流動(dòng)相A

 

衍生過程:200mM 硼酸緩沖液(5μL)+樣品(1μL)+OPA/MPA溶液(1μL)+FMOC溶液(1μL)+稀釋液(8μL)

 

儀器型號(hào):

UltiMate3000:

LPG-3400,SN:8014896

WPS-3000TSL, SN:8014671

TCC-3000, SN:801179

DAD, SN:8037084

變色龍®色譜管理軟件(Chromeloeon®6.8 SR11)

 

 

色譜條件:

色譜柱 : Hypersil GOLD C18色譜柱, 4.6×250mm, 5μm, PN:25005-254630

 

流動(dòng)相 :A: 20mM 乙酸鈉(加0.018%三乙胺,調(diào)節(jié)pH值至7.2,再加入0.3%四氫呋喃),B:100mM乙酸鈉(pH=7.2)-乙腈-甲醇(20:40:40)

 

梯度洗脫程序

 

進(jìn)樣量: 1μL

檢測器:檢測波長:380nm, 262nm, 3D掃描:190-400nm,采集頻率:5Hz

流速: 1000μL/min

柱溫:  35°C

 

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

 

01

水解條件優(yōu)化

在水解過程中,加熱溫度、水解持續(xù)時(shí)間和催化劑用量對(duì)水解有著重大影響。結(jié)合實(shí)際情況采用沸水浴加熱進(jìn)行水解,因此利用響應(yīng)面法對(duì)水解時(shí)間和催化劑用量的影響進(jìn)行了研究,結(jié)果見表1和圖1。

 

 

表1 水解研究方案

 

圖1 氨基酸水解優(yōu)化結(jié)果

從圖1中可以看出,水解時(shí)間延長對(duì)氨基酸增加效果不明顯,水解催化劑用量對(duì)水解效率有顯著影響,隨著用量增大,氨基酸含量明顯增加,且達(dá)到大值,再增加用量時(shí),氨基酸含量開始降低,可能原因是水解后的氨基酸在強(qiáng)酸性環(huán)境與高溫加熱條件下中發(fā)生降解從而引起含量降低。綜合實(shí)際操作考慮,故用0.6ml水解催化劑在沸水浴中水解8小時(shí)可獲得佳水解氨基酸含量。

 

02

 方法專屬性

取0.1N鹽酸做為空白試劑考察方法專屬性,結(jié)果見圖2和3。

 

 

03

線性范圍

取氨基酸混標(biāo)溶液用1%鹽酸(約0.1N)稀釋成濃度為0.025、0.05、0.125、0.25、0.50μmol/ml的溶液,按照前述條件測定其響應(yīng)值,并與濃度做線性回歸,結(jié)果見表4。

 

04

方法精密度

取對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5針,結(jié)果見圖4。

 

05

方法度

按前述方法平行測定母乳樣品與加標(biāo)樣品,計(jì)算其含量與加標(biāo)回收率。結(jié)果見圖5與表5。

 

表5加標(biāo)回收率(樣品編號(hào):12-8,n=2)

 

結(jié)論

 

通過上述方法學(xué)考察結(jié)果分析,本方法具有線性范圍寬、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確,可用于母乳中測定氨基酸含量。

 

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